細胞培養(yǎng)環(huán)境

1、實驗室設計 細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受 其它有害因素的影響。細胞培養(yǎng)室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響， 要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養(yǎng)室的設計原則一般是無菌 操作區(qū)設在室內較少走動的內側，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一 室。

2、常用設施及設備

（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側流式、直流式和外流式三大類。

（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作 臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及 消毒好的無菌物品等。

（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物

（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

（5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。

3、培養(yǎng)器皿 常用細胞培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等。常準備量是使用量的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、利于細胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品 或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。

（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常用規(guī)格有 500 ml、250 ml、100 ml 等幾種。

（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細胞傳代培養(yǎng)的細 胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于

1 cm，允許吸管伸入瓶內任何部位，規(guī)格有 200 ml、100 ml、50 ml、25 ml、10 ml 等幾種。

（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑 30 mm、60 mm、120 mm 等幾種。

（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有 球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用 1 ml 和 10 ml 兩種。短吸管也叫滴 管，分彎頭和直頭兩種。

（5）離心管：離心管是細胞培養(yǎng)中使用廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用 于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為 50 ml、

30 ml、15 ml；后者則多為 10 ml 和 5 ml。

（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

4、細胞培養(yǎng)溫度

維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細胞對培養(yǎng)溫度要求也不同。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為 36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過 39℃ 時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在 39-40℃1 小時，即能受到一定損傷，但仍有 可能恢復；在 40-41℃1 小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復；41-42℃1 小 時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在 43℃ 以上 1 小時，細胞全部死亡。相反，溫度不低于 0℃ 時，對細胞代謝雖有影響，但并無傷害作 用；把細胞放入 25－35℃ 時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在 4℃ 數(shù)小時后，再回到 37℃ 培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長。細胞代謝隨溫度降低而減慢。當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是，如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如－80℃ 或－196℃（液氮）長期保存。

5、合適的氣體環(huán)境

氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧

氣參與三羧酸循環(huán)，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。 開放培養(yǎng)時一般把細胞置于 95% 空氣加 5% 二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基

的 pH 值。大多數(shù)細胞的適宜 pH 為 7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產生有害的影響。 但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。但有一些細胞也喜歡偏 堿環(huán)境中生長，如成纖維細胞適合 pH 是 7.4-7.6。每種細胞都有其適 pH 值。

細胞培養(yǎng)無菌操作基本技術

無菌操作技術分為三個部分：工作環(huán)境及表面的處理，細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理及培養(yǎng)液與培養(yǎng)細胞的處理。

工作環(huán)境的處理 使用層流超凈工作臺是經濟有效的手段。超凈工作臺正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超凈臺。

（1）實驗前，無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射 30-60 分鐘滅菌，用 70% 酒精擦拭無菌 操作臺面，并開啟無菌操作臺風機運轉 10 分鐘后，才可開始實驗操作。每次操作只 處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。實驗結束后，將實驗物品帶出工作臺。如需 要繼續(xù)進行下一個實驗，則用 70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風機運 轉 10 分鐘后，才可進行下一個實驗操作。

（2）無菌操作工作區(qū)域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以 暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出，以利氣體流通。實驗用品要用 70% 酒精 擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內進行，勿在邊緣 非無菌區(qū)域操作。

（3）小心取出無菌實驗用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要 在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。

（4）工作人員應注意自身的安全，必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性 或病毒感染的細胞株應特別小心，并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺（至少兩級）。操作過 程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖 銳物品傷人等。

（5）定期檢查下列項目：CO2 鋼瓶內的 CO2 壓力；CO2 培養(yǎng)箱內的 CO2 濃度、溫度、及水盤 是否有污染；無菌操作臺內氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及 HEPA 過濾器濾膜， 預濾網(wǎng) ﹙300 小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA）。

培養(yǎng)細胞生長過程：潛伏期→指數(shù)增生期→停滯期

潛伏期 (latent phase)

細胞接種后, 先經過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期. 此時, 細胞質回縮, 胞體呈圓球形. 然后細胞貼附于載體表面, 稱貼壁, 懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類, 培養(yǎng)基 成分, 載體的理化性質等密切相關。一般情況下，原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢, 可達 10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常 10-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期. 原代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約 24-96 小時或更長, 連續(xù) 細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需 6-24 小時。

(2) 指數(shù)增生期 (logarithmic growth phase)

這是細胞增殖旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為 判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表 示，即細胞群中每 1000 個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于 0.1%-0.5%，原 代細胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂相指數(shù)可高達 3％－5％。指數(shù)增生期 的細胞活力時期，是進行各種實驗時期，也是凍存細胞的時機。在接種細 胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù) 3－5 天后，隨著細胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少， 后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑 制現(xiàn)象 (contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導致 細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接 觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數(shù)仍然在增多。但是，當 細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養(yǎng)枯竭和代 謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。

（3）停滯期 (Stagnate phase)

細胞數(shù)量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時 細胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如 不進行分離傳代，細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒，出 現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發(fā)生死亡，因此，應及時傳代。

培養(yǎng)細胞基本形態(tài)

培養(yǎng)細胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的，結構不明顯。細胞在生長期常有 1-2 個核仁。在細胞機能狀態(tài)不良時，細胞輪廓會增強，反差增大。若胞質中時而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔 泡等，表明細胞代謝不良。

體外培養(yǎng)細胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生 長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養(yǎng)時能貼附在支持物表面生長。如羊水細胞為貼 附型細胞，常表現(xiàn)為成纖維型細胞和上皮細胞生長。懸浮型細胞在培養(yǎng)中懸浮生長。

（1）成纖維型細胞 在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態(tài)與體內成纖維細胞的形態(tài)相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細胞中央有卵園形核，胞質向外伸出 2-3 厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外， 凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態(tài)生長。

（2）上皮型細胞 此類型細胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征，細胞中央有園形核，細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養(yǎng)時，皆呈上皮型形態(tài)生長。

（3）游走型細胞 本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質經常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細膩包形態(tài)。常 見于羊水細胞培養(yǎng)的早期。